來(lái)源：本站 作者：jiyuanbio 時(shí)間：2025/2/19
數(shù)字 PCR 技術(shù)的原理和優(yōu)勢(shì)如下：
數(shù)字 PCR 是將含有核酸分子的熒光 PCR 反應(yīng)體系隨機(jī)分散到成千上萬(wàn)個(gè)單獨(dú)的納升級(jí)反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器或不含待檢核酸靶分子，或含有至少一個(gè)待檢核酸靶分子1。其過(guò)程主要包括以下步驟：
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分散體系：將樣本充分稀釋并分配到多個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元中，如基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字 PCR 會(huì)通過(guò)油包裹 PCR 體系形成無(wú)數(shù)個(gè)油包水微滴，每個(gè)微滴是一個(gè)獨(dú)立反應(yīng)單元；基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字 PCR 則利用微流控芯片裝置使 PCR 反應(yīng)體系準(zhǔn)確快速地分散于芯片孔中。
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PCR 擴(kuò)增：在每個(gè)反應(yīng)單元中進(jìn)行單獨(dú)、平行的 PCR 反應(yīng)，對(duì)目標(biāo)核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增。
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信號(hào)檢測(cè)：擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有熒光信號(hào)的反應(yīng)器判讀為 “1”，沒(méi)有熒光信號(hào)的反應(yīng)器判讀為 “0”，從而將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化，最終根據(jù)泊松分布原理以及陰 / 陽(yáng)性反應(yīng)的比例，直接計(jì)算反應(yīng)體系中待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度。
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絕對(duì)定量：常規(guī) PCR 和實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量檢測(cè)需已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn) DNA 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，會(huì)因樣品測(cè)定條件差異造成 PCR 擴(kuò)增效率不同，影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性。而數(shù)字 PCR 不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可直接讀出 DNA 的分子個(gè)數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
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高靈敏度：能檢測(cè)到極低拷貝數(shù)的核酸分子，原則上最低可檢測(cè)到 1 個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子，可有效區(qū)分與監(jiān)測(cè)微量濃度變化，能精確地檢測(cè)到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，比如可以檢測(cè)出體細(xì)胞中含量極低的單個(gè)突變，能識(shí)別低至 1/100,000 的變異頻率1。
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高耐受性：目的序列被分配到多個(gè)微滴或反應(yīng)單元中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小，對(duì)樣品的純度要求相對(duì)沒(méi)那么苛刻，在檢測(cè)復(fù)雜樣本或含有抑制劑的樣本時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。
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樣品需求量低：在檢測(cè)珍貴樣品和樣品核酸存在降解時(shí)具有明顯優(yōu)勢(shì)，只需少量的樣本即可進(jìn)行檢測(cè)，能夠節(jié)約珍貴的生物樣本。
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可進(jìn)行多重檢測(cè)：多個(gè)單一的反應(yīng)單元為多目標(biāo)序列的高通量檢測(cè)提供了基礎(chǔ)，可同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)核酸分子進(jìn)行檢測(cè)和分析，提高檢測(cè)效率和信息獲取量。
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結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性好：由于每個(gè)反應(yīng)單元獨(dú)立進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)，減少了反應(yīng)之間的干擾和誤差，使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性更高，不同批次實(shí)驗(yàn)之間的差異也較小。
